样板细节

文件 免疫组化实验流程

1. 试剂 

1.1 脱蜡液:二甲苯或者Histoclear 

1.2 各个浓度梯度的乙醇:无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇和75%乙醇 

1.3 洗液:TBST(1× TBS/0.1% Tween-20, pH 7.4±0.2) 

1.4 纯水(dH2O) 

1.5 抗原修复液:0.01M Tris-EDTA, pH 9.0±0.1 或 0.01M Sodium Citrate Buffer, pH 6.0±0.1 

1.6 3% 过氧化氢 

1.7 封闭液:10%山羊血清(非免疫动物血清) 

1.8 抗体稀释液:PBS或者商业化血清 

1.9 二抗:Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP polymer) 

1.10 苏木素 

1.11 封片剂(中性树脂) 

2. 染色步骤  

2.1 脱蜡水化 

2.2 烤片:在烘箱(63℃ -65℃)中烤片约1小时。 

2.3 用二甲苯或组织透明剂和梯度酒精进行脱蜡水化:两次二甲苯或组织透明剂(每次5-10min),两次无水乙醇(每次5min),两次95%乙醇(每次5min),1次85%乙醇(每次5min),1次75%乙醇(每次5min),最后用水洗三次。  

2.2 抗原修复 

推荐使用抗原修复锅进行热修复(高温或高温高压)。 

2.2.1 向抗原修复锅中加入500ml纯水。 

2.2.2 将切片放入含有抗原修复液的染色缸中,并将染色缸放入抗原高压修复锅。注:根据产品说明书,选择合适的修复液。 

2.2.3 120-125℃ 30s,或者110℃ 15-30min。 

注:根据抗原修复锅说明书和切片质量,设置抗原修复条件。 

2.2.4 取出切片,让切片缓慢降温至室温(10-30min)。 

2.2.5 将切片移至纯水中。 

2.3 染色   

2.3.1 用纯水洗切片三次,每次3min。 

2.3.2 将切片浸泡于3% 过氧化氢中5-10min,该步骤用于阻断内源性过氧化物酶干扰。 

2.3.3 用TBST洗切片一次(3min)。 

2.3.4 加封闭液,室温封闭30-60min。 

2.3.5 根据产品说明书用一抗稀释液稀释一抗。 

2.3.6 加一抗,之后将切片存放置于湿盒内,4℃孵育过夜。 

2.3.7 用TBST洗切片三次(每次3min)。 

2.3.8 加二抗,室温孵育30min。 

注:推荐使用Polymer二抗,请根据产品说明书选择孵育二抗的条件。 

2.3.9 用TBST洗切片三次(每次3min)。 

2.3.10 加新鲜配制的DAB显色(约0.5-2min)。根据具体产品说明书配置DAB,选择合适的显色时间和显色次数。 

2.3.11 用水清洗切片。 

2.3.12 用苏木素染液复染(1-10min),将切片浸泡于TBST返蓝。根据染色程度和说明书介绍,选择复染时间。 

2.3.13 用纯水清洗切片。 

2.3.14 用梯度酒精和二甲苯或组织透明剂进行脱水:75%乙醇(3min),95%乙醇(3min),两次100%乙醇(每次3min),两次二甲苯或组织透明剂(每次5min) 

2.3.15 干燥切片,然后用永久封片剂封片。 

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