样板细节

文件 免疫沉淀(IP)实验流程

注意:该流程基于96孔板检测体系,请根据实际检测体系调整用量。

1. 试剂

1.1 1xTBS:商品化

1.2 Rabbit IgG:商品化

1.3 2xSDS上样缓冲液

125mM Tris-Hcl (pH6.8)

2.5% SDS

0.04% Bromophenol Blue

25% Glycerol

0.1M DTT

ddH2O

2. 实验步骤

2.1 按照每200ul 1xTBS中加入10ul磁珠的比例制备磁珠预混液,将预混液加入U型底96孔板中,每孔200ul

2.2 于磁力架上放置1min,弃上清。

2.3 每孔加入200ul 1xTBS2ug一抗,吹打混匀,置于水平摇床室温孵育1h。用2ug rabbit IgG代替一抗作为对照。

2.4 将孔板置于磁力架上放置1min,弃上清。每孔加入200ul 1xTBS清洗2遍。

2.5 每孔加入100ul裂解液重悬,置于水平摇床上4oC孵育过夜。

注:裂解液总蛋白浓度需为3.5mg/ml左右。如为冷冻裂解液,需在冰上融化后,10000rpm离心2min去除细胞和组织碎片。

2.6 置于磁力架上放置1min,弃上清。每孔加入200ul 1xTBS清洗2遍。

2.7 加入100ul 1xTBS重悬并转移到PCR板中,将孔板置于磁力架上放置1min,弃上清。

2.8 加入25ul 2xSDS上样缓冲液重悬,同时取15ul裂解液上清加入15ul 2xSDS上样缓冲液作为input样本,贴膜封好。

2.9 PCR板置于金属加热器中100oC加热5min

2.10 800g 离心 30s 。吸取上清进行电泳,转膜和蛋白免疫印迹操作。
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