样板细节

文件 LC3B

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Western Blot

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靶点概述

LC3B是一个广泛使用的自噬标志物。自噬机制通过降解病原体、聚集的有毒蛋白质及旧的或受损的细胞器来维持细胞环境的稳态(PMID:18191218)。LC3B I主要位于细胞质中,LC3B II主要位于自噬体膜上和自溶体中(PMID: 11060023)。在自噬体形成过程中,溶酶体水解酶大量降解LC3B II (PMID: 16874052),因此,在样本中加入足量蛋白酶抑制剂十分重要。
在不同的样本中,检测到的LC3B I和II的比例可能不同。
在一些未处理的样本中LC3B信号可能很弱,使用巴佛洛霉素A1 /雷帕霉素/羟氯喹/氯喹处理样本可能提高信号强度(PMID: 27846905, 30966861, 26775710, 31574376)。
由于LC3B本身的特性容易产生多条条带,建议使用特异性更高的单抗以获得更理想的实验结果。

 

以下有一些小贴士,有助于获得理想的WB结果:

样本制备

●添加足够量的蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。

●整个样本制备过程中,保持样本置于冰上

●通过 Bradford 分析、 Lowry 分析或 BCA 分析 测定样本总蛋白浓度。

电泳

●对于小分子量蛋白 推荐 使用 15% 或更高浓度的分离胶 电泳。

●至少上样 20μg 总蛋白进行电泳。

转膜

●对于小分子量蛋白,推荐使用 0.22 μm 孔径的膜。

●强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。

 

以下有一些注意事项,有助于获得更好的 WB 实验结果:

  • 如果LC3B信号很弱,使用巴佛洛霉素A1 /雷帕霉素/羟氯喹/氯喹处理样本可能提高LC3B表达量

  • 不同的样本中LC3B I和II表达比例可能不同。部分样本检测结果如下:

  • 类型

    样本中相对表达量

    小鼠大脑组织

    RAW 264.7

    U-87 MG

    LC3B I

    LC3B II

    较高

  • 为了得到更好的实验结果,推荐首选单克隆抗体产品。假如选用了多克隆抗体,建议在实验时加入阴性对照以便确认目的条带。
 

蛋白功能

类泛素修饰剂参与自噬体液泡(自噬体)的形成。在线粒体中发挥作用,通过消除线粒体至基础水平来满足细胞能量需求并防止过量的ROS产生,从而调节线粒体的数量和质量。
虽然LC3参与了吞噬膜的伸长,但GABARAP / GATE-16亚家族对于自噬小体成熟的后期至关重要。通过自噬途径从中心粒状卫星中去除OFD1,从而促进原发性纤毛发生。通过其与网状细胞受体TEX264的相互作用,在营养胁迫下参与内质网亚结构域重塑成自噬体,然后与溶酶体融合以实现内质网更新。
SwissProt: Q9GZQ8
PMID: 28017329, 31006538, 31006537, 20418806, 23209295, 24089205

组织表达

心脏,大脑,骨骼肌和睾丸中含量最高。
在肝脏中观察到很少的表达(PMID: 12740394)。

细胞定位

细胞骨架,内膜系统; 脂质锚
自噬体膜

注意:LC3-II与自噬膜结合。LC3-II在Parkin介导的线粒体吞噬过程中定位于线粒体内膜,也定位于沿睫状轴突的离散点。
PMID: 20529957, 23459205, 28017329

异构体

人(Q9GZQ8): 15kD (预测)
小鼠(Q9CQV6):15kD (预测)
大鼠(Q62625): 16kD(预测)

修饰

脂化
前体分子被ATG4B裂解形成胞质形式LC3-1。它被APG7L / ATG7激活,转移到ATG3并与磷脂结合形成膜结合形式LC3-II。
与MAPK15的相互作用减少了抑制性磷酸化并增加了自噬活性。
PMID: 15187094, 22948227

由于 LC3B存在翻译后修饰,在 WB 中检测的条带大小可能与预测值不一致。

阳性对照

WB: 氯喹处理的HeLa全细胞裂解液

具体信息请查阅相应抗体说明书推荐。

阴性对照

WB:Human MAP1LC3B knockout HepG2 cell line (ab277828)

具体信息请查阅相应抗体说明书推荐。

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